實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)分為制備性離心機(jī)和分析性離心機(jī),制備性離心機(jī)主要用于分離各種生物材料,每次分離的樣品容量比較大,分析性離心機(jī)一般都帶有光學(xué)系統(tǒng),主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì),依據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為(用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)),能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。分析性離心機(jī)都是超速離心機(jī)。
1.制備性離心機(jī)可分為三類:
⑴普通離心機(jī):大轉(zhuǎn)速6000rpm左右,大相對(duì)離心力近6000×g,容量為幾十毫升至幾升,分離形式是固液沉降分離,轉(zhuǎn)子有角式和外擺式,其轉(zhuǎn)速不能嚴(yán)格控制,通常不帶冷凍系統(tǒng),于室溫下操作,用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì),如紅血球、酵母細(xì)胞等。這種離心機(jī)多用交流整流子電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng),電機(jī)的碳刷易磨損,轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié),起動(dòng)電流大,速度升降不均勻,一般轉(zhuǎn)頭是置于一個(gè)硬質(zhì)鋼軸上,因此地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要,否則會(huì)損壞離心機(jī)。
⑵高速冷凍離心機(jī):大轉(zhuǎn)速為20000~25000rpm(r/min),大相對(duì)離心力為89000×g,大容量可達(dá)3升,分離形式也是固液沉降分離,轉(zhuǎn)頭配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動(dòng)式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng),以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量,離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0~40C,轉(zhuǎn)速、溫度和時(shí)間都可以嚴(yán)格準(zhǔn)確地控制,并有指針或數(shù)字顯示,通常用于微生物菌體、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞器、硫銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作,但不能有效地沉降病毒、小細(xì)胞器(如核蛋白體)或單個(gè)分子。
⑶超速離心機(jī):轉(zhuǎn)速可達(dá)50000~80000rpm,相對(duì)離心力大可達(dá)510000×g,的生產(chǎn)廠商有美國(guó)的貝克曼公司和日本的日立公司等,離心容量由幾十毫升至2升,分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離,離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機(jī)的出現(xiàn),使生物科學(xué)的研究領(lǐng)域有了新的擴(kuò)展,它能使過(guò)去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細(xì)胞器得到分級(jí)分離,還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。
超速離心機(jī)主要由驅(qū)動(dòng)和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。超速離心機(jī)的驅(qū)動(dòng)裝置是由水冷或風(fēng)冷電動(dòng)機(jī)通過(guò)精密齒輪箱或皮帶變速,或直接用變頻感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng),并由微機(jī)進(jìn)行控制,由于驅(qū)動(dòng)軸的直徑較細(xì),因而在旋轉(zhuǎn)時(shí)此細(xì)軸可有的彈性彎曲,以適應(yīng)轉(zhuǎn)頭輕度的不平衡,而不致于引起震動(dòng)或轉(zhuǎn)軸損傷,除速度控制系統(tǒng)外,還有一個(gè)過(guò)速保護(hù)系統(tǒng),以防止轉(zhuǎn)速超過(guò)轉(zhuǎn)頭大規(guī)定轉(zhuǎn)速而引起轉(zhuǎn)頭的撕裂或,為此,離心腔用能承受此種的裝甲鋼板密閉。
溫度控制是由安裝在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接并連續(xù)監(jiān)測(cè)離心腔的溫度,以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控,這種紅外線溫控比高速離心機(jī)的熱電偶控制裝置更敏感,更準(zhǔn)確。
超速離心機(jī)裝有真空系統(tǒng),這是它與高速離心機(jī)的主要區(qū)別。離心機(jī)的速度在2000rpm以下時(shí),空氣與旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭之間的磨擦只產(chǎn)生少量的熱,速度超過(guò)20000rpm時(shí),由磨擦產(chǎn)生的熱量顯著增大,當(dāng)速度在40000rpm以上時(shí),由磨擦產(chǎn)生的熱量就成為嚴(yán)重問(wèn)題,為此,將離心腔密封,并由機(jī)械泵和擴(kuò)散泵串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空,溫度的變化容易控制,磨擦力很小,這樣才能達(dá)到所需的超高轉(zhuǎn)速。
2.轉(zhuǎn)頭:
⑴角式轉(zhuǎn)頭:角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的,其上有4~12個(gè)裝離心管用的機(jī)制孔穴,即離心管腔,孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在20~40度之間,角度越大沉降越結(jié)實(shí),分離效果越好。這種轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點(diǎn)是具有較大的容量,且重心低,運(yùn)轉(zhuǎn)平衡,壽命較長(zhǎng),顆粒在沉降時(shí)先沿離心力方向撞向離心管,然后再沿管壁滑向管底,因此管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積,此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)",壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對(duì)流擾亂,影響分離效果。
⑵水平式轉(zhuǎn)頭:這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶(離心套管)構(gòu)成。當(dāng)轉(zhuǎn)頭靜止時(shí),吊桶垂直懸掛,當(dāng)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達(dá)到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時(shí),吊桶蕩至水平位置,這種轉(zhuǎn)頭適合做密度梯度區(qū)帶離心,其優(yōu)點(diǎn)是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中,離心時(shí)被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸,而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成角度,因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點(diǎn)是顆粒沉降距離長(zhǎng),離心所需時(shí)間也長(zhǎng)。
⑶區(qū)帶轉(zhuǎn)頭:區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無(wú)離心管,主要由一個(gè)轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成,轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置,把桶內(nèi)分隔成四個(gè)或多個(gè)扇形小室,隔板內(nèi)有導(dǎo)管,梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進(jìn)液管泵入,通過(guò)這些導(dǎo)管分布到轉(zhuǎn)子四周,轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭,在徑向的散射離心力作用下,顆粒的沉降距離不變,因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應(yīng)"極小,可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂,分離效果好,而且還有轉(zhuǎn)速高,容量大,回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點(diǎn),使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點(diǎn)是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭,耐腐蝕要求高,操作復(fù)雜。
⑷垂直轉(zhuǎn)頭:其離心管是垂直放置,樣品顆粒的沉降距離短,離心所需時(shí)間也短,適合用于密度梯度區(qū)帶離心,離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向,因而降速要慢。
⑸連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭:可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離,轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似,由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成,離心時(shí)樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭,在離心力作用下,懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁,上清液由出口流出。
3.離心管:
離心管主要用塑料和不銹鋼制成,塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸酯(PC),聚丙烯(PP)等,其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是透明(或半透明),硬度小,可用穿刺法取出梯度。缺點(diǎn)是易變形,抗有機(jī)溶劑腐蝕性差,使用壽命短。
不銹鋼管強(qiáng)度大,不變形,能抗熱,抗凍,抗化學(xué)腐蝕。但用時(shí)也應(yīng)避免接觸強(qiáng)腐蝕性的化學(xué)藥品,如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等。
塑料離心管都有管蓋,離心前管蓋蓋嚴(yán),倒置不漏液。管蓋有三種作用:
①防止樣品外泄。用于有放射性或強(qiáng)腐蝕性的樣品時(shí),這點(diǎn)尤其重要。②防止樣
品揮發(fā)。③支持離心管,防止離心管變形。
4.分析性離心機(jī):
分析性離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng),以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程。從而確定其物理性質(zhì)。
分析性超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的,以避免應(yīng)力集中于孔處。此轉(zhuǎn)頭通過(guò)一個(gè)有柔性的軸聯(lián)接到一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置上,轉(zhuǎn)頭在一個(gè)冷凍的和真空的腔中旋轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)頭上有2~6個(gè)裝離心杯的小室,離心杯是扇形石英的,可以上下透光,離心機(jī)中裝有一個(gè)光學(xué)系統(tǒng),在整個(gè)離心期間都能通過(guò)紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測(cè)離心杯中沉降著的物質(zhì),在預(yù)定的期間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片,在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時(shí),在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡,結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照像底板上產(chǎn)生了一個(gè)“峰",由于沉降不斷進(jìn)行,界面向前推進(jìn),因此峰也移動(dòng),從峰移動(dòng)的速度可以計(jì)算出樣品顆粒的沉降速度。
分析性超速離心機(jī)和主要特點(diǎn)就是能在短時(shí)間內(nèi),用少量樣品就可以得到一些重要信息,能夠確定生物大分子是否存在,其大致的含量,計(jì)算生物大分子的沉降系數(shù),結(jié)合界面擴(kuò)散,估計(jì)分子的大小,檢測(cè)分子的不均一性及混合物中各組份的比例,測(cè)定生物大分子的分子量,還可以檢測(cè)生物大分子的構(gòu)象變化等。
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